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諾博萊德 高爾基體膜蛋白提取試劑盒
高爾基體膜蛋白提取試劑盒 常備現貨
產品貨號：P4922
產品名稱：高爾基體膜蛋白提取試劑盒
產品規格：50T/100T
產品簡介：
中文名稱：高爾基體膜蛋白提取試劑盒
規格：50T ; 100T
儲存條件：2-8℃，1 year
具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準
NobleRyder P4922 高爾基體膜蛋白提取試劑盒
適用樣本
動物細胞/組織
產品介紹
高爾基體膜蛋白提取試劑盒可用于各種動物細胞和實體軟、硬組織樣本的高爾基體膜蛋白的提取。
本試劑盒提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白質電泳、免疫沉淀、ELISA、轉錄活性 分析、Gel shift 凝膠阻滯實驗、酶活性測定等下游蛋白研究實驗。
本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構象的活性蛋白。
本試劑盒中不含有 EDTA，與金屬螯和層析等下游應用兼容。
注：
1. 蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。
2. 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。
3. 試劑拆封后請盡快使用完！
產品簡介：
高爾基體膜蛋白提取試劑盒可用于各種動物細胞和實體軟、硬組織樣本的高爾基體膜蛋白的提取。
本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質電泳、免疫沉淀、ELISA、轉錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實驗、酶活性測定等下游蛋白研究實驗。
本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構象的活性蛋白。
本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應用兼容
自備試劑和儀器
離心機、振蕩器、勻漿機/勻漿器、渦旋混勻器、移液器、冰箱、冰盒，PBS緩沖液、蛋白定量試劑盒，離心管、吸頭、一次性手套
產品特點：
1、使用方便，從細胞，組織中提取蛋白不需經過研磨、反復凍融、超聲破碎等前處理。
2、提取過程簡單方便。
3、含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。
4、紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。
5、總蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結合釋出的蛋白防止沉淀。
6、蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含 6 種立的蛋白酶抑制劑 AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、PepstatinA、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲an酸蛋白酶、半胱an酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
使用方法：
一、使用注意事項：
1. 正式實驗前請選取幾個樣本做預實驗，以優化實驗條件，取得優良實驗效果
2. 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋和管內壁上的液體離心至管底，避免開蓋時試劑損失。
3. 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
4. 最好使用Dounce勻漿器勻漿，如果沒有Dounce勻漿器，也可用普通玻璃勻漿器勻漿，但是高爾基體蛋白回收率會下降。
5. 用Dounce勻漿器勻漿是高爾基體膜蛋白提取的關鍵的步驟，故勻漿前最好先通過預實驗確定不同組織樣本的最適勻漿次數，方法是每勻漿5-10次后，取2-3μl勻漿液到載玻片上，然后在相差顯微鏡下觀察，完整細胞數量降低到20%以下為佳。此鏡檢步驟非必須步驟，但是會影響高爾基體膜蛋白的回收率。在樣本極難獲取的實驗中，務必做鏡檢。
6. 提取液C在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。
7. 膜蛋白電泳時loading buffer應該避免煮沸。
8. 膜蛋白電泳時可以提高loading buffer的SDS含量。
9. 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會影響使用效果。
10. 樣品或試劑被細菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會導致錯誤的結果。
二、操作步驟
提取液準備：
每200ul冷的蛋白提取液C中加入1ul蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
每200ul冷的蛋白提取液D中加入1ul蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
細胞高爾基體膜蛋白提取
1.取1—2×107個細胞，在4℃，500×g條件下離心2-3分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集細胞。
2.用冷PBS洗滌兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
3.加入500ul冷的試劑A，置冰上10分鐘。
4.用Dounce勻漿器勻漿充分勻漿。
5.然后在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。
6.棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
7.在4℃，3000×g力條件下離心10分鐘。
8.棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
9.在4℃，10000×g力條件下離心10分鐘。
10.棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
11.在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。棄上清。
12.在沉淀中加入400ul冷的試劑B，混勻。
13.在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。
14.棄上清，沉淀中加入100-200ul冷的蛋白提取液C，充分混勻。
15.在2-8℃條件下振蕩30-40分鐘，至沉淀充分裂解，無明顯沉淀。
16.在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。
17.將上清吸入另一干凈離心管，在37℃水浴10分鐘。
18.在37℃，1000×g力離心5分鐘，此時溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為20-30ul。
19.小心移除上層液體，收集上層部分留作備用分析。
20.用50-100ul冷的試劑D膜蛋白溶解液溶解下層高爾基體膜蛋白部分，即得高爾基體膜蛋白。
21.將高爾基體膜蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實驗。
組織高爾基體膜蛋白提取：
1.取50-100mg新鮮動物組織樣本，用PBS洗滌干凈。
2.用剪刀盡可能剪碎，用冷PBS洗滌兩次。
3.加入500ul冷的試劑A，置冰上10分鐘。
4.用Dounce勻漿器充分勻漿30-40下，至無明顯固體團塊。
5.然后在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。
6.棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
7.在4℃，3000×g力條件下離心10分鐘。
8.棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
9.在4℃，10000×g力條件下離心10分鐘。
10.棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
11.在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。棄上清。
12.在沉淀中加入400ul冷的試劑B，混勻。
13.在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。
14.棄上清，沉淀中加入100-200ul冷的蛋白提取液C，充分混勻。
15.在4℃條件下振蕩30-40分鐘，至沉淀充分裂解，無明顯沉淀。
16.在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。
17.將上清吸入另一干凈離心管，在37℃水浴10分鐘。
18.在37℃，1000×g力離心5分鐘，此時溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為20-30ul。
19.小心移除上層液體，收集上層部分留作備用分析。
20.用50-100ul冷的試劑D膜蛋白溶解液溶解下層高爾基體膜蛋白部分，即得高爾基體膜蛋白。
21.將高爾基體膜蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實驗。
注：
①蛋白濃度低？
處理部分樣本時可能沒有裂解wan全，導致蛋白濃度低。只要適當延長試劑C的處理時間即可。最好在持續振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
②用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。
③提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結構，沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構象和活性。
注意事項：
1. 本試劑盒僅供科學研究使用，不可用于診斷或治療。
2. 最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并che底清除殘留清潔劑。
3. 實驗后完成后所有樣品及接觸過的器皿應按照規定程序處理。
4. 避免皮膚或粘膜與試劑接觸。
高爾基體膜蛋白提取試劑盒 常備現貨
產品訂購信息：
P4922 高爾基體膜蛋白提取試劑盒 50T/100T
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