亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/48S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的mei，廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為 NO 或NH3，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對(duì)生物體的毒害作用。

測(cè)定原理：

亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的 NO —減少，即540nm 處吸光值的變化可反映亞硝酸還原酶的活性。

亞硝酸還原酶試劑盒 氮代謝系列-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 5ml 蒸餾水溶解。

試劑三：液體 5ml×1 瓶，4℃保存。（如出現(xiàn)沉淀可以 70-80℃加熱溶解）

試劑四：液體 10ml×1 瓶，4℃避光保存。（如出現(xiàn)沉淀可以 70-80℃加熱溶解）工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以 1:1 的比例混合。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

天平、研缽、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、水浴鍋、低溫離心機(jī)。

酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g， 4℃離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作表：

計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.3594x + 0.0072，R² = 0.9997；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml），y 為吸光值（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）。

1. 按照蛋白含量計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷（V 樣×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072）÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T = 1.47×（A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072）÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h /10⁴ cell）= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T = 1.47×（A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072）÷細(xì)胞數(shù)量

V 標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.04ml；V 樣：體系中加入樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.6797x + 0.0072，R² = 0.9997；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml），y 為吸光值（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）。

1. 按照蛋白含量計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V 標(biāo)÷（V 樣×Cpr）÷T = 2.94×（A空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072）÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V 標(biāo)÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T = 2.94×（A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072）÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（μmol/h /10⁴ cell）= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V 標(biāo)÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T = 2.94×（A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072）÷ 細(xì)胞數(shù)量

V 標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.04ml；V 樣：體系中加入樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)：

1. 配制好的工作液 3 天內(nèi)使用完。

2. 若吸光值超過(guò) 1.5，將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3. 嚴(yán)格控制顯色時(shí)間，否則會(huì)對(duì)結(jié)果有影響。

4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為 0.03μmol/ml-1.5μmol/ml。

5. A 空白管-（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）線性范圍為 0.02-1.5。

亞硝酸還原酶試劑盒 氮代謝系列-常備現(xiàn)貨