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凋亡DNA Ladder快速ti取試劑盒
凋亡DNA Ladder快速ti取試劑盒 核酸提取
目錄號：40116
目錄編號 | 包裝單位 |
40116-20 | 20次 |
40116-50 | 50次 |
適用范圍：
試劑盒組成 | 保存 | 20次 | 50次 |
裂解/結合液CB | 室溫 | 6ml | 15ml |
漂洗液WB | 室溫 | 6ml | 15ml |
第一次使用前按說明加zhi定量乙chun | |||
洗脫緩沖液EB | 室溫 | 15ml | 15ml |
吸附柱AC | 室溫 | 20個 | 50個 |
收集管（2ml） | 室溫 | 20個 | 50個 |
適用于快速提取凋亡DNA Ladder
試劑盒組成、儲存、穩定性：
本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。
儲存事項:
1. 裂解/結合液CB低溫時可能出現析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。
具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準
產品介紹：
細胞發生凋亡時，染色質DNA在核小體之間發生斷裂，最終形成200bp整數倍的DNA片段，這些DNA片段被提取后，經電泳及溴化乙錠染色后形成梯子狀外觀，謂之DNA Ladder。血液和組織培養細胞在裂解/結合液中裂解后，釋放出來的DNA片段在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，將鹽、細胞代謝物、蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將DNA Ladder片段從硅基質膜上洗脫。
產品特點：
1. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙chun沉淀等步驟。
2. 本公司du有的裂解/結合液配方有效裂解細胞，使用本試劑盒不需要加入昂貴的蛋白meiK處理，大大降低了使用成本和加快了處理速度。
3. 節省時間，簡捷，單個樣品操作一般可在10分鐘內完成。
1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13,000rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2. 開始實驗前將需要的水浴先預熱到70℃備用。
3. 裂解/結合液CB含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
4. 一般2×106培養細胞DNA產量為10-20μg， 200μl人全血典型產量為3-6μg。
5. 一般電泳檢測時典型上樣量為2-3μg純化的DNA，如果凋亡率低，有可能只見到基因組DNA，而見不到DNA ladder，可以試試加大上樣量。
操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
提示： 第一次使用前請先在漂洗液WB中加入zhi定量無水乙chun，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙chun，以免多次加入!
1. 取2×106個細胞（懸浮細胞或者組織培養細胞重懸在200μl PBS中）或者200μl全血（大約含有2×106個細胞）加入200μl 裂解/結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻。
可選做步驟: 如果RNA殘留較多，影響凋亡DNA ladder的觀察，可以在加入200μl裂解/結合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
細胞或者全血處理起始量最大可達300μl，如果起始量介于200μl-300μl之間，則需要按比例相應提高后面使用試劑量。
2. 室溫（15℃-20℃）放置10分鐘。
3. 加入100μl 異丙chun，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。
上述步驟中適當力度充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低產量。如果樣品粘稠不易混勻，則可以渦旋振蕩15秒。
4. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。
5. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙chun!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
6. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
7. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙chun影響洗脫效率和下游反應。
8. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預熱）， 室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。
9. DNA可以直接使用或者存放在－20℃，但是不要超過14天。
10. 取大約2-3μg純化的DNA電泳檢測（注意200μl人全血典型產量只有3--6μg）。
問題 | 評論與建議 |
沒有DNALadder | *細胞未凋亡或者凋亡細胞率太低-建議：提高凋亡劑的濃度或者延長凋亡誘導時間 |
未見到DNALadder | *分離的DNA產量太低-建議：加大起始細胞處理量，按比例擴大試劑使用量。確保做了步驟7，以免乙chun殘留降低洗脫效率。 *樣品本身含有DNA量少（如人全血），電泳上樣量太低，-建議：可以加大洗脫下來純化DNA的電泳上樣量。 |
DNA彌散， | *凋亡晚期，非特異的剪切DNA所致-建議：在凋亡較早期時提取DNA Ladder（或者做多個不同時期動態連續檢測）。 |
背景高， | *RNA污染太多，影響了觀測-建議：將洗脫的純化DNA加入DNase free的RNase 至終濃度2μg/ml，室溫（15℃-20℃）放置20分鐘降解污染的RNA。此外, 正常細胞含有更多的RNA,凋亡細胞比例過低時易殘留更多RNA,因此RNA殘留較多,往往提示凋亡細胞比例過低,可以根據實際情況調整誘導條件. |
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