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M13噬菌體單鏈基因組DNA快速ti取試劑盒
M13噬菌體單鏈基因組DNA快速提取試劑he
目錄號：40211
目錄編號 | 包裝單位 |
40211-50 | 50次 |
40211-100 | 100次 |
40211-200 | 200次 |
適用范圍：
適用于快速提取M13噬粒單鏈DNA
試劑盒組成、儲存、穩定性：
試劑盒組成 | 保存 | 50次 | 100次 | 200次 |
結合液MB | 室溫 | 25ml | 50ml | 100ml |
漂洗液WB | 室溫 | 15ml | 25ml | 2×25 ml |
第一次使用前按說明加zhi定量乙chun | ||||
洗脫緩沖液EB | 室溫 | 10ml | 20ml | 40ml |
吸附柱AC | 室溫 | 50個 | 100個 | 200個 |
收集管（2ml） | 室溫 | 50個 | 100個 | 200個 |
本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。
儲存事項:
1. 結合液MB低溫時可能出現析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。
具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準
產品介紹：
M13和其它的絲狀噬菌體載體，在文庫構建和為序列測序提供單鏈DNA和引人突變方面十分有用。將適量M13絲狀噬菌體或者相關噬粒（M13來源）感染的液體培養物離心，上清中的單鏈噬菌體DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，將鹽、細胞代謝物，蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈噬菌體單鏈DNA從硅基質膜上洗脫。
產品特點：
1. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙chun沉淀等步驟。
2. 節省時間，簡捷，單個樣品操作一般可在10分鐘內完成。
3. 產量高，典型的產量800µl M13絲狀噬菌體上清可以提取3µg噬菌體單鏈DNA。
4. 多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9。可以直接用來測序，一般典型可辨認讀長達650bp。
注意事項：
1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13,000rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2. 開始實驗前將需要的水浴先預熱到50℃備用。
3. 結合液MB含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
操作步驟:（實驗前請先閱讀注意事項）
以800μl噬菌體感染細菌培養上清提取舉例:
提示：第一次使用前請先在漂洗液WB中加入zhi定量無水乙chun，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙chun，以免多次加入!
1. 將M13絲狀噬菌體或者相關噬粒（M13來源）感染的液體培養物分裝在1.5毫升離心管，12,000rpm離心5分鐘沉淀菌體。
2. 小心取800μl上清轉入新的1.5ml離心管，加入400μl結合液MB，充分混勻。
如果使用的上清大于或者小于800μl，則結合液MB的用量需要按照比例增加或者減少。
3. 將上述混合物加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液。
吸附柱一次最多只可以容納大約700μl混合物，因此需要分次把混合物加到吸附柱內，重復步驟3。
4. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙chun!），12,000rpm 離心30秒，棄廢液。
5. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙chun抑制下游反應。
6. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加60μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 50℃水浴中預熱）， 室溫放置1分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。如果想得到較多量的DNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，10,000rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于40μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。
7. DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。
附錄（M13噬菌體感染細菌培養上清準備過程）:
下面舉例說明M13噬菌體感染細菌培養上清準備過程，詳細的M13噬菌體（或M13來源噬粒）培養和上清準備過程請參見『分子克隆』第二版。
1. 37℃ 振搖過夜培養合適的噬菌體宿主菌（如JM109）。
2. 使用6％的過夜培養菌接種新鮮的LB培養液，37℃振搖培養一個小時。
3. 根據M13噬菌體的儲存液的濃度（滴度）按照0.5-1.5%(V/V)的比例加入噬菌體來感染宿主菌。37℃振搖培養5-6個小時。
4. 將上面M13絲狀噬菌體或者相關噬粒（M13來源）感染的液體培養物分裝在1.5毫升離心管，12,000rpm離心5分鐘沉淀菌體。
5. 可選步驟: 小心取1毫升上清轉入新的1.5ml離心管， 重復步驟4離心5分鐘。
這步有助于去除上清中殘留的微量宿主菌RNA或者DNA。
6. 小心取800μl上清轉入新的1.5ml離心管。
7. 現在可以按照操作步驟提取噬菌體單鏈DNA了。
v 問題與解決方法:
問題 | 評論與建議 |
低核酸產量 | *試劑盒儲存在非優良條件-建議：收到試劑盒后總是存放在室溫（15℃-20℃） *緩沖液或者試劑暴露于減少它們有效性的條件下-建議：儲存在室溫（15℃-20℃），每次用完后立刻蓋緊蓋子，以免溶液蒸發，pH改變和污染。 *漂洗液WB中忘記加無水乙chun-建議：第一次實驗時，在漂洗液WB中加入zhi定量無水乙chun。 *試劑和樣品沒有充分混勻-建議：加入每個試劑后都要充分混勻 *噬菌體上清滴度太低-建議：離心取噬菌體感染細菌培養物上清時離心最好不要超過5分鐘，轉速不要超過12,000rpm，否則噬菌體上清也可能離心下來。重新培養一次噬菌體感染細菌 *洗脫效率不高-建議：確保做了步驟5，否則殘留乙chun會影響洗脫 |
DNA下游mei切 | *忘記做步驟5，乙chun抑制了mei切反應-建議：做步驟5，然后空氣中晾幾分鐘，讓殘留乙chun揮發。 *一些硅基質膜成分一起洗脫下來，抑制了mei切反應-建議：將洗脫的基因組DNA溶液13,000rpm再離心一分鐘，小心取上清使用 |
純化的DNA | *一些硅基質膜成分一起洗脫下來，干擾了分光光度計讀數-建議：將洗脫的回收DNA溶液13,000rpm再離心一分鐘，小心取上清使用。 |
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