一步法無縫克隆試劑盒不依賴于T4連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制，而直接用重疊片段重組的方法，采用特殊的酶組合可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有16-25bp重疊區(qū)域的PCR片段定向重組連接
One Step Seamless Cloning Kit 無縫克隆

One Step Seamless Cloning Kit (單片段)

One Step Seamless Cloning Kit 無縫克隆

目錄號：42111

包 裝 量：

產(chǎn)品儲存：-20°C保存，避免多次反復(fù)凍融

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

制品說明：一步法無縫克隆試劑盒不依賴于T4連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制，而直接用重疊片段重組的方法，采用特殊的酶組合可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有16-25bp重疊區(qū)域的PCR片段定向重組連接，可以30分鐘內(nèi)實現(xiàn)A末端或者平末端PCR產(chǎn)物片段高效定向無縫克隆至載體的任意位點。

產(chǎn)品特點：

1.  30分鐘可以將一個50bp-15kb PCR擴增片段（平/A末端）克隆插入任意載體的任意位置。

2.不受載體和插入片段酶切位點的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位點進(jìn)行克隆。

3.  無縫克隆，插入點不會引入不需要的堿基序列。

4.  不依賴于連接酶及磷酸酶，高效，準(zhǔn)確，克隆陽性率可達(dá)95%以上。

一步法無縫克隆試劑盒原理示意圖：

線性化載體和插入DNA片段的制備：

A：線性化載體的制備

(1). 酶切來源：酶切所得線性載體，平末端或者粘端、單酶切或者雙酶切均可，酶切后膠回收。

注： 一步法無縫克隆反應(yīng)體系內(nèi)無雙鏈DNA連接酶，不會發(fā)生載體自連反應(yīng)。因此，即使是以單酶切方式制備的線性化載體也無需進(jìn)行末端脫磷酸處理。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)的假陽性克隆 (無插入片段) 是由酶切不wan全未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。我們推薦酶切后膠回收可以把這種未線性化載體比例降低到zui低程度。

(2). 反向PCR來源：建議使用高保真DNA聚合酶（貨號：P517-05或者P812-05）制備，如果擴增條帶單一可以通過PCR產(chǎn)物純化（貨號：DC012-50）獲得載體，否則通過膠回收（貨號：DC011-50)獲得載體。

注：反向PCR的質(zhì)粒模板也是非線性化載體，也可能導(dǎo)致假陽性克隆（無插入片段），因此PCR來源線性載體（PCR產(chǎn)物）純化前用Dpn I內(nèi)切酶消化質(zhì)粒模板，可以降低背景，提高陽性率。但是一般情況下，經(jīng)過膠回收已經(jīng)足以把這種未線性化載體比例降低到zui低，因此反向PCR來源的線性化載體我們也推薦膠回收。

B：插入DNA片段的制備

(1). 一步法無縫克隆引物設(shè)計總的原則是：通過在引物5’ 端引入線性化克隆載體末端同源序列，使得插入片段擴增產(chǎn)物5’和3’最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應(yīng)的wan全一致的序列 (16 bp～20 bp)。

(2). 插入片段引物設(shè)計：克隆引物包括插入片段特異性引物序列和重疊序列。

克隆正向引物(5’-3’)：線性載體正向16-25 nt重疊區(qū)序列(3’末端算起)+插入片段正向特異引物序列（18-25 nt）

克隆反向引物(5’-3’)：線性載體反向16-25 nt重疊區(qū)序列(3’末端算起)+插入片段反向特異引物序列（18-25 nt）

注意：重疊區(qū)的堿基數(shù)至少16 bp，并且多段重疊區(qū)域之間的Tm值需保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)，否則可延長堿基數(shù)目直到符合要求。

按照線性載體末端的結(jié)構(gòu)（5’突出，3’突出，平末端），引物設(shè)計也分3種情況，示意如下：

線性化載體的兩端因線性方式（如單酶切、雙酶切、反向PCR）不同，可以是以上三種末端結(jié)構(gòu)的兩兩任意組合，插入片段特異性引物設(shè)計的原則遵循一般引物設(shè)計的原則即可。

計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，載體末端同源序列不應(yīng)參與計算。

(3). 酶的選擇：建議使用高保真DNA聚合酶或者PCR Mix（貨號：P517-05或者P814-05）。

(4). 反應(yīng)條件：一般按照具體使用的聚合酶說明書進(jìn)行即可。

(5). 純化插入片段

l   可選：如果片段來源于質(zhì)粒模板，且該質(zhì)粒與重組載體具有相同抗性，純化前用Dpn I內(nèi)切酶消化質(zhì)粒模板， 可降低背景，提高陽性率。

l   如果片段單一，則建議用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（貨號：DC012-100）純化片段。

l   如果有非特異擴增，則建議用膠回收試劑盒（貨號：DC011-100)回收片段。

l   使用該方法克隆，用來線性化載體的酶切位點在拼接的時候會缺失，如果對酶切位點有嚴(yán)格要求的，建議注意酶切位點的選擇，必要時可在正反向克隆引物的重疊區(qū)序列和特異基因序列之間增加缺失掉的堿基來恢復(fù)原有酶切位點（見后面舉例說明）。

l   如果重組質(zhì)粒用于蛋白表達(dá)，則在引物設(shè)計時注意讀碼框，蛋白表達(dá)及純化所需序列（如啟動子，RBS序列，起始密碼子，終止密碼子，蛋白標(biāo)簽等）不被破壞。

正向引物設(shè)計舉例說明（EcoR I 酶切開）：

如上圖，載體由Ecor I 酶切開，形成5’突出末端：

根據(jù)上述設(shè)計原則，從3’端開始計算，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列），加到目的片段特異引物序列前面即可。確保重疊區(qū)域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

正向引物具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物設(shè)計完成克隆連接后，EcoR I 酶切位點將會消失（不保留酶切位點）。

如果需要保留 EcoR I 酶切位點，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補齊缺失的EcoR I 識別位點序列aattc，完成克隆連接后，EcoR I 酶切位點依然存在（保留酶切位點）。

具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

反向引物設(shè)計舉例說明（Hind III 酶切開）：                           

如上圖，載體由Hind III 酶切開，形成5’突出末端：

根據(jù)上述設(shè)計原則，從3’端開始計算，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列），加到目的片段特異引物序列前面即可。確保重疊區(qū)域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

反向引物具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物設(shè)計完成克隆連接后，Hind III 切位點將會消失（不保留酶切位點）。

如果需要保留 Hind III 酶切位點，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補齊缺失的Hind III 識別位點序列agctt ，Hind III 酶切位點依然存在（保留酶切位點）。

具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

無縫克隆反應(yīng)的操作步驟：

注意：2 × OneStep Cloning Mix 含有連接增強劑PEG很粘稠，從冰箱拿出來溫度低時更粘稠，可以放在手心化凍幾分鐘提高溫度便可降低粘稠度（不影響質(zhì)量），輕彈混勻，瞬間離心收集到管底。

1.   按照下表建立反應(yīng)體系（可使用PCR管在室溫配制）

* 載體一般用20-50 ng，插入片段與載體的摩爾比在2:1-3:1之間最佳；如果插入片段小于200bp，插入片段與載體的摩爾比用5:1 。

2.      輕輕混勻，在50°C反應(yīng)15分鐘（可在PCR儀器上進(jìn)行），反應(yīng)結(jié)束后，將PCR管置冰上后直接轉(zhuǎn)化或者保存于-20°C。較短片段例如100bp-1kb只需要15分鐘便能獲得足夠轉(zhuǎn)化子，較長片段的連接，可以延長反應(yīng)時間到60分鐘。

3.     取5μl 反應(yīng)產(chǎn)物按照感受態(tài)細(xì)胞說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)化（如果轉(zhuǎn)化子較少，可以將所有的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并將所有的轉(zhuǎn)化液涂板）。

陽性克隆的鑒定：

可根據(jù)具體情況，選擇菌落PCR鑒定，提取質(zhì)粒（貨號31013-100）進(jìn)行限制性內(nèi)切酶鑒定或測序鑒定。

One Step Seamless Cloning Kit 無縫克隆