4-香豆酸：fu酶A 連接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL)試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

4CL 是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶，主要催化肉桂酸生成相應(yīng)的肉桂酸fu酶A酯，是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理，為減少水果石細胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

測定原理：

4CL 催化 4-香豆酸和CoA 生成 4-香豆酸CoA，在 333nm 下測 4-香豆酸CoA 生成速率，即可反映 4CL活性。

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試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

粗酶液提取：

細菌或培養(yǎng)細胞：

先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計 40℃預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 333nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1） 在試劑二中加入 12.5ml 試劑一充分溶解混勻，置于 40℃水浴預(yù)熱 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 24h

內(nèi)用完）；

（2） 測定管：在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本和 950μl 試劑二，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃

反應(yīng) 30min 后的吸光值A2。

對照管：在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本和 950μl 試劑一，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃

反應(yīng) 30min 后的吸光值A1，計算ΔA=A2-A1。

注意：每個測定管設(shè)一個對照管。

4CL 活性計算：

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol4-香豆酸fu酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸fu酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=31.75×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸fu酶A 定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.063×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：4-香豆酸fu酶A 摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，30 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

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