磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

PEPCK（EC 4.1.1.32）廣泛存在于動物、植物、微生物和細胞中，催化草酰乙酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸，是調節糖異生途徑的關鍵酶。

測定原理：

PEPCK 催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化 NADH氧化生成NAD⁺，在 340nm 下測定NADH 下降速率，即可反映 PEPCK 活性。

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組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1 μl 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

樣本的前處理：

1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（μl）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1μl 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(μl)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1μl 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

3、試劑四的配制：臨用前加入 2.5μl 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

4、將工作液和試劑四置于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預熱 5 分鐘。

5、在 1μl 石英比色皿中加入 50μl 樣本、50μl 試劑四和 900μl 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：在該試劑盒中，若ΔA 大于 0.1，需將樣本用提取液稀釋適當倍數后測定，使ΔA 小于 0.1 可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

PEPCK 活性計算：

1、血清（漿）PEPCK 活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/μl））＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=3215×ΔA 2、組織、細菌或細胞中 PEPCK 活力計算

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=3215×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=6.43×ΔA

V 反總：反應體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.05 μl；V 樣總：加入提取液體積，1 μl；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/μl；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

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