脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

DHAR 存在于細胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中。DHAR 催化GSH 還原DHA 生成AsA 和GSSG，調(diào)控細胞AsA/DHA 比值，是抗壞血酸-谷胱甘tai氧化還原循環(huán)的關鍵酶。提高植物體內(nèi)的 DHAR 活性，可提高植物食品中AsA 含量，進而提高植物食品的營養(yǎng)品質(zhì)。

測定原理：

DHAR 催化GSH 還原DHA 生成AsA，通過測定DHA 減少速率，計算 DHAR 活性。

脫氫抗壞血酸還原酶試劑盒-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑三：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入 2.5 ml 蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 2.5 ml 蒸餾水充分溶解。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

自備儀器和用品：

研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

粗酶液提取：

1. 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；8000g 4℃離心 20min，取上清液置冰上混勻待測。

3. 血清等液體：直接測定。

DHAR 測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 265nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預熱 30 min。

3. 在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μl 試劑三、20μl 試劑四和 140μl 試劑二，最后加 20μl 上清液迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值A1 和A2，△A=A2-A1。

DHAR 活性計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個細胞每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 92×△A ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/ml) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣÷T

= 92×△A

ε ：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：摩爾分子換算成微摩爾分子；d：比色杯光徑，1cm；V 反總：反應體系總體積，0.2ml=2×10^-4 L；V 樣：反應體系中加入上清液體積，20μl =0.02ml； V 樣總：提取液體積，1 ml；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml；W ：樣品質(zhì)量；T：反應時間，2 min。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T

= 184×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 184×△A ÷W

(3). 按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個細胞每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 184×△A ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/ml) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣÷T

= 184×△A

ε ：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：摩爾分子換算成微摩爾分子；d：96 孔板 光徑，0.5 cm；V 反總：反應體系總體積，0.2ml=2×10^-4 L；V 樣：反應體系中加入上清液體積，20μl =0.02ml； V 樣總：提取液體積，1 ml；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml；W ：樣品質(zhì)量；T：反應時間，2 min。

注意事項：

臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完。

脫氫抗壞血酸還原酶試劑盒-常備現(xiàn)貨